Colorazione al blu di metilene delle cellule di lievito – metodica OIV
La conta delle cellule vive prima del tiraggio è un’operazione indispensabile per controllare la vitalità del piede d’inoculo e la capacità di condurre la successiva presa di spuma.
1 Campo d’applicazione
Questo metodo consente di valutare rapidamente la percentuale di cellule vitali di lievito, che non assumono colorazione, dato che le cellule morte si colorano di blu; è applicabile a tutti i campioni contenenti lieviti, tranne i mosti contenenti più di 100 g/l di zucchero.
I batteri sono troppo piccoli, perciò la loro colorazione non è rilevabile con questo metodo.
Nota: è importante la focalizzazione delle cellule a varie profondità, per visualizzarne correttamente la colorazione con il blu di metilene.
2 Principio
Il blu di metilene è trasformato nel suo derivato incolore dall’attività riduttrice delle cellule di lievito vitali. Le cellule di lievito morte assumeranno la colorazione blu.
La vitalità si calcola sulla base del rapporto tra cellule vitali e le cellule totali. Questo metodo sovrastima la vitalità “reale” se le cellule vitali sono meno dell’80%, poiché esso non fa distinzione tra le cellule “vive” e la loro capacità di riprodursi (Cellule vitali ma non adatte a coltura).
Se la concentrazione di zucchero supera i 100 g/l, quasi tutte le cellule sono celesti, rendendo sconsigliabile questo metodo.
Il colorante non può funzionare correttamente con i vini a basso pH e fortemente tamponati. In questi casi il conteggio va eseguito almeno sulla prima diluizione decimale.
3 Reagenti e materiali
Soluzione A: Soluzione di blu di metilene in acqua distillata, 0,1 g/500 mL.
Soluzione B: Soluzione di KH2PO4,in acqua distillata, 13,6 g/500 mL.
Soluzione C: Soluzione in acqua distillata di Na2HPO4 x 12 H2O, 2,4 g/100 mL
Soluzione D: 498.75 mL di Soluzione B + 1,25 mL di soluzione C.
Soluzione E: Mescolare i 500 mL di soluzione D con 500 mL di soluzione A per ottenere la soluzione finale tamponata di blu di metilene, con pH 4,6 circa.
4 Impianti e attrezzature
Microscopio, 250-500 x ingrandimenti. Contrasto di fase controindicato.
Vetrini e vetrini di protezione scorrevoli per microscopio o emocitometro (camera di Thoma, Bürker o Neubauer).
Provette da test e asta agitatrice.
Pipette, puntali sottili.
5 Tecniche di esame
Determinazione della vitalità
Diluire il lievito in sospensione con la soluzione di blu di metilene in una provetta da test, fino a che la sospensione non abbia circa 100 cellule di lievito in un campo microscopico. Deporre una piccola goccia di sospensione ben mescolata su un vetrino da microscopio e coprire con un vetrino coprioggetti.
Esaminare al microscopio con un ingrandimento di 400 x entro 10 minuti dal contatto con il colorante.
Contare un totale di 400 cellule, annotando il numero di cellule morte, rotte, avvizzite e plasmolizzate colorate di blu. Le cellule di lievito in fase di gemmazione si contano come una cellula unica se le dimensioni della gemma sono inferiori alla metà della cellula madre. Se le dimensioni della gemma sono uguali o maggiori di metà di quelle della cellula madre, si contano entrambe le cellule.
Le cellule colorate di celeste vanno considerate vive.
6 Espressione dei risultati
Siano T il numero totale delle cellule e C il numero delle cellule colorate di blu; la percentuale delle cellule vitali è allora x100
Cellule vitali: T -C/T x 100
7 Riferimenti
European Brewery Convention. Analitica Microbiologica – EBC. Fachverlag Hans Carl, 2001